结核分枝杆菌实验室检测方法ppt

医学科 ：xxx 时间：20XX.XX MEDICAL NURSING 分枝杆菌属 一类细长略带弯曲，有时呈分枝状的杆菌，本属细菌多具有抗酸性， 又称抗酸杆菌（acid-fast bacillus），细菌体内含有分枝菌酸，细 胞壁含有大量脂类，这与分枝杆菌的染色性、抵抗力和致病性等密 切相关。 本属细菌已经被鉴定的有70多种，可分为三大类：结核分枝杆菌、 非典型分枝杆菌、麻风分枝杆菌； 按生长速度可分为三类，即缓慢生长菌、迅速生长菌和不能培养菌 三种类型 结核分枝杆菌群 结核分枝杆菌，是人和动物结核病的病原体，包括人 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分 支杆菌（M.bovis）、非洲分支杆菌（M.africanum） 和田鼠分枝杆菌（M.microti），前三种对人类治病， 其中人型结核分枝杆菌感染发病率最高。 结核分枝杆菌属于缓慢生长分支杆菌 非典型分枝杆菌 偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌龟/脓肿、胞内分枝杆菌、鸟 分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆 菌、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、土分枝杆菌、草分枝 杆菌、不产色分枝杆菌、海-溃疡分枝杆菌、金色分枝杆 菌、苏尔加分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌等 偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌龟亚种、龟分枝杆菌脓肿亚种 属于迅速生长型，鸡蛋培养基上3-5天可见菌落 其他非典型分枝杆菌多为缓慢生长型 麻风分枝杆菌 麻风分枝杆菌（M.leprae）是麻风病的病原体，也是抗酸 杆菌，但较结核分枝杆菌短而粗，两端尖细，抗酸染色着 色均匀，呈束状或团状排列，结核分枝杆菌多散在，偶有 聚集。为典型的胞内寄生菌，有麻风杆菌存在的细胞胞浆 呈泡沫状，称麻风细胞。 体外不能培养。 结核分枝杆菌 全球约有1/3的人口已经感染结核分枝杆菌，有 2000万活动性肺结核患者，每年新发病例900万 人，每秒钟有1人感染结核，每年有300万人死 于结核病。 随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的 改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降 20世纪80年代后，由于艾滋病和结核分枝杆菌 耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、 贫困及人口流动等因素，全球范围内结核病的 疫情骤然恶化 6 生物学形状 结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，有时可见 分枝状，无芽孢和鞭毛，因衰老或抗结核药物的 作用可出现多形态，如球状、串珠状或丝状， 大小为1～4X0.4μm。 细胞壁中含有大量脂质而不易着色，特别是有 大量分枝菌酸包围在肽聚糖层的外面，一般 用抗酸染色。萋尼染色呈红色，背景为蓝色； 荧光染料金胺“O”染色，荧光显微镜下为橘黄色 培养特性 培养基 营养要求高，必须在含血清，卵黄，马铃 薯，甘油及无机盐类的特殊培养基上生长， 常用的有罗氏固体培养基 专性需氧，3%-5%CO2能促进其生长最 培养条 适温度为35-37℃，最适pH为6.5-6.8 件 菌落粗糙型，表面干燥成颗粒状，不透明， 菌落特 乳白色或淡黄色，菜花样 点 8 实验室检测方法 病原学 免疫学 分子生物学 萋尼染色+荧光染色 罗氏培养+分枝杆菌快速培养 抗原抗体检测 细胞因子检测 荧光定量PCR 芯片杂交 涂片镜检--抗酸染色 抗酸染色是目前为止最快的结核检出方法， 可用来检测病情进展，为感染控制提供参 考依据，可确证培养物为阳性 萋尼染色法—红色—普通显微镜（高倍） 荧光染色—黄或橘色—荧光显微镜（低倍） 联染法：敏感性高，特异性好，速度快！ 抗酸染色局限性 抗酸染色对分枝杆菌非特异，其他如Nocardia（奴卡）、 Rhodococcus（红球菌属）、Legionella micdadei（军团 菌）、cryptosporidium（隐孢子虫）、Isospora（等孢球 虫）等有抗酸菌特点 不能区分结核和非结核分枝杆菌 不能区分活菌和死菌 敏感性差，一般1mL痰中有5000-10000条菌时可检出，而 培养可检出>10-100条菌. 发光二极管荧光显微镜（LED） 荧光显微镜成本高、易损坏、耗电量大、光源 寿命短、显微镜价格昂贵且需要在暗室内工作 等，荧光染色法一直没有在结核病痰涂片诊断 中得到广泛的应用。 只需将二极管替换普通光学显微镜的目镜就相 当于一台荧光显微镜，组装的“荧光显微镜” 结合金胺O染色在结核病痰涂片检查中有一定 的应用价值。 田斌等，发光二极管荧光显微镜在基层实验室诊断结核分枝杆菌的应用评价. 实用预防医学2012年10月第19卷第10期. 分枝杆菌培养技术 结核菌培养仍是目前诊断的金标准．尤其是药敏试验结果在指导临 床用药及耐药性检测等方面具有重要作用, 是鉴定是否为活菌的可 靠方法． 1、传统的固态培养法 需要4～6周才能检测到结核菌的生长．而且阳性率也只有30％-40 ％；特异性差．各种分枝杆菌均可生长。要确定是否为结核菌．需结 合分枝杆菌菌种鉴定和药物敏感性试验。 2、分枝杆菌快速液体培养技术 BD公司推出的BACTEC—MGIT 960全自动分枝杆菌培养， 鉴定／药敏系统，操作简便，阳性标本检出时间平均为9d： 鉴定、药敏试验时间平均为4d：阳性标本检出率比传统固 体培养提高10％左右 固体培养和液体培养优缺点 固体培养：污染少，易于进行菌落形态观察，但是培养时 间长 液体培养：菌体与培养基充分接触，生长迅速，但易受到 污染 血清学试验 表1 多种类型的血清学检测方法 抗原 38KDa.16KDa,88KDa.MPT51,苹果酸合成酶CFP10,TbF6多聚蛋白,85B抗 原,A60抗原,5抗原,a-晶体蛋白,2,3二酰基海藻糖,2,3,6-三酰基海藻糖,2,3,6,6-四 酰基海藻糖2-硫酸盐(SL-),索状因子,结核磷脂,脂阿拉伯甘露糖,Rv3425 复合物 蛋白,脂类,多糖 构成 单抗原,抗原组合 来源 天然,重组 Ig类型 天然,重组 ELISA,免疫层析法,免疫斑点法,凝集试验 免疫学检测方法 1、结核菌素试验 凡感染过结核杆菌的机体，会产生相应的致敏淋巴细胞， 具有对结核杆菌的识别能力，当再次遇到通过皮肤注入的 少量的结核菌素时，致敏Ｔ 淋巴细胞受相同抗原再次刺激 会在48-72小时内，产生局部炎症反应，出现红肿硬节即为 阳性反应。 对活动性结核的诊断灵敏度高达77％， 局限性： 假阴性： 小儿结核、老年人结核、免疫缺陷或免疫功能低下患者 （如合并HIV感染、接受免疫抑制剂治疗的患者) 假阳性： 接种过卡介苗的人也会产生阳性反应 γ干扰素释放试验 被认为是近十年来结核诊断史上取得的最重要成就，该检测 方法的原理是：结核感染后体内长期存在抗原特异性的记忆 性Ｔ 细胞，当再次遇到抗原刺激时，能迅速活化增值，释放 γ干扰素。 目前市售两种， QFT-G和T-SPOT.TB，比较两种方法， TSPOT.TB更灵敏但QFT-G更特异，但均优于结核菌素试验， 同时也被推荐用于潜伏结核诊断。 分子生物学检测方法 近年来核酸扩增技术和杂交分析技术的发展，为分枝杆菌 的检测、鉴定和药敏实验提供了极大的方便，可将诊断时 间从几周降低到几天。研究、应用报道较多的结核病基因 诊断技术主要包括聚合酶链反应(PCR)、核酸探针杂交、 DNA序列测定、基因芯片、基因分型等。 分枝杆菌分子诊断系统（协和医院） 实时荧光PCR 基因芯片快速检测平台 分枝杆菌核酸检测 分枝杆菌菌种鉴定 结核分枝杆菌耐药基 因检测 筛查、鉴别诊断 菌种鉴定 MDR早期诊断 分枝杆菌核酸检测 功能：TB快速筛查；TB/NTM鉴别诊断 高 快 灵 效： 一个样本可同时检测结核分枝杆菌和NTM 速： 4周（菌培） 3 小时 敏： 10 个菌/反应（TB）；102 个菌/反应（NTM） 22 分枝杆菌菌种鉴定（DNA微阵列芯片法） 检测范围：结核、胞内、鸟、戈登、堪萨斯、偶然、瘰疬、浅黄、 土、龟-脓肿、草、不产色、海-溃疡、金色、苏尔加、蟾蜍、耻垢。 高 快 灵 效： 同时检测 17 种分枝杆菌（包括TB） 速：＞4周（菌种鉴定） 6 小时 敏： 103 个菌/反应 23 结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒 基于rpoB（利福平）和katG/inhA（异烟肼）的基因突变，对 耐多药结核病做出快速诊断。 通 量：两个一线抗结核药（MDR） 速 度：8周（药敏） 6 小时 灵敏度：103 个菌/反应 24 五种结核检测方法效果评价 涂片法 MGIT 960 快速培养 斑点层析法 结核组：1260例 非结核组：100例 结果比较 改良罗 氏培养 荧光 PCR 快速培养和荧光PCR 方法 表1 五种检测方法对结核病组及非结核病组临床标本的检测结果比较 结核病组(n=1260) 非结核病组(n=100) 阳性 阴性 阳性 阴性 涂片法 312 948 0 100 改良罗氏培养法 463 797 0 100 快速培养法 741 519 0 100 荧光定量PCR法 701 559 2 98 斑点免疫层析法 616 645 28 72 快速培养和荧光PCR 涂片检查 表3 改良罗氏培养法与快速培养法对 1260例结核病患者临床标本检测结果的比较 改良罗氏培养法 快速培养法 例数 阳性率(%) 污染率(%) 平均培养时间 （d） 阳性率(%) 污染率(%) 平均培养时间 （d） 涂阳 375 70.1 2.1 17.6 94.0 3.5 9.1 涂阴 885 17.2 1.9 28.3 56.9 3.2 13.6 快速培养和荧光PCR 表4 快速培养法与荧光定量PCR法对1260例结核病患者临床标本检测结果的比较 快速培养法 荧光定量 PCR 法 涂片检查 例数 阳性数 阳性率(%) 阳性数 阳性率(%) 涂阳 275 259 淡标本 涂阴 685 355 非痰标本 涂阳 100 88 涂阳 200 12 94.0 248 90.2 56.9 362 52.8 88.0 65 65.0 6.0 13 6.5 总结： 涂片简单快速但阳性率较低、难以区分结核和非结核分 枝杆菌 培养为金标准，但需时较长 血清学试验检测结核抗原或抗体不太理想 γ干扰素释放试验能较好地为临床服务 荧光PCR检测结核分枝杆菌具有较好的敏感性和特异性， 可结合传统方法综合分析 医学科 ：xxx 时间：20XX.XX MEDICAL NURSING